摘要
關(guān)鍵詞：疫苗接種，佐劑，現(xiàn)代技術(shù)，未來展望。
疫苗接種無疑是人類歷史上最顯著的健康成就之一。在短短的兩個多世紀(jì)，疫苗使我們能夠?qū)崿F(xiàn)不同尋常的目標(biāo)，例如徹底消滅天花，在世界大部分地區(qū)消滅小兒麻痹癥，以及在一些國家大幅度降低許多傳染病的死亡率和發(fā)病率。在世界上許多地方疫苗接種政策是公共衛(wèi)生的基石，安全有效的疫苗受到人們極大的關(guān)注。疫苗的效力不僅取決于抗原成分，還取決于佐劑，其以一種更有效的方式刺激免疫系統(tǒng)。佐劑被定義為添加到疫苗中的成分，以改善對抗原的免疫反應(yīng)。此外，佐劑有幾個優(yōu)點，如減少每劑疫苗的抗原量和疫苗接種次數(shù)，在某些情況下，它們增加抗原成分的穩(wěn)定性，延長其半衰期并間接提高其免疫原性?，F(xiàn)有許多不同類型的佐劑用于疫苗生產(chǎn)（表1）。
表1 根據(jù)佐劑的主要作用機制分類
佐劑根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，例如它們的物理化學(xué)性質(zhì)、來源和作用機制。最受關(guān)注的分類系統(tǒng)之一是基于其作用機制，將其分為兩大類:遞送系統(tǒng)(顆粒)和免疫增強劑。另一類佐劑是粘膜佐劑，這是一組與前面的佐劑具有某些特征的化合物。在遞送系統(tǒng)佐劑中，抗原與佐劑相結(jié)合，特別是作為抗原載體。此外，它們能夠通過激活先天免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)局部促炎反應(yīng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞募集到免疫部位。確切地說，抗原-佐劑復(fù)合物通過病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)激活模式識別受體(PRR)途徑。這引起先天免疫細(xì)胞的激活，伴隨有細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。同樣的途徑被免疫增強劑直接激活（圖1）。
圖1 佐劑的作用機制
添加佐劑對老年人使用的疫苗特別有效，因為這類受試者會出現(xiàn)免疫衰老的生理現(xiàn)象，它在自然感染或人工刺激(接種疫苗)后導(dǎo)致免疫反應(yīng)減弱。在這種情況下，佐劑的存在可使疫苗克服這一限制。而且，佐劑對亞單位疫苗特別有用，因為亞單位疫苗通常免疫原性弱，無法單獨刺激強烈的免疫反應(yīng)。然而，并非所有疫苗都需要佐劑。例如獲得認(rèn)證的腦膜炎球菌結(jié)合疫苗不含佐劑，因為與蛋白質(zhì)載體的結(jié)合本身能夠刺激良好的免疫反應(yīng)。表2列出了目前認(rèn)證的佐劑疫苗。
表2 當(dāng)前通過FDA和EMA認(rèn)證的人用佐劑疫苗
如表所示，目前絕大多數(shù)由EMA和FDA批準(zhǔn)的人用疫苗都包括鋁鹽佐劑。鑒于這些佐劑是疫苗配方中使用最早的佐劑，為了提高疫苗的安全性和有效性，增加新佐劑的數(shù)量是絕對必要的，因此，有必要加強對具有佐劑特性的新分子和因子的研究，增加體外和體內(nèi)研究的數(shù)量。與此同時，由于佐劑的使用和研究、新細(xì)胞底物的使用或工藝變更或轉(zhuǎn)移申請方面的監(jiān)管挑戰(zhàn)，新產(chǎn)品的批準(zhǔn)可能會受到延遲和提高成本。這方面可能成為抑制新奇事物、增加成本和延遲疫苗適用性的障礙，特別是在資源匱乏的國家。
此外，2019冠狀病毒病大流行凸顯了獲得有效疫苗以應(yīng)對新的大流行潛在威脅的重要性。事實上，COVID-19的RNA疫苗具有內(nèi)在佐劑特性，其與編碼RNA載體的脂質(zhì)體成分相關(guān)。然而，最新認(rèn)證的COVID-19疫苗是基于含有刺突蛋白的經(jīng)典平臺，并添加了一種名為Matrix-M的新佐劑，該佐劑含有皂角提取物的成分A和C。
在選擇疫苗佐劑時需要考慮很多方面，其中安全性是第一位。一種好的佐劑必須是安全的，耐受性好，易于生產(chǎn)的；具有良好的藥學(xué)特性(pH值、滲透壓、內(nèi)毒素水平等)以及保質(zhì)期長；最后，在經(jīng)濟(jì)上可行。在不影響佐劑安全性的前提下兼顧所有這些特性是很困難的。因此，目前使用的疫苗中佐劑應(yīng)用較少。
盡管疫苗取得了巨大的成就，但近幾十年來，人們對這些產(chǎn)品產(chǎn)生了許多擔(dān)憂。一種反對疫苗的文化即“疫苗猶豫”已在世界范圍內(nèi)蔓延。2019冠狀病毒病(COVID-19)大流行刺激了“疫苗猶豫”，它一方面表明了疫苗接種作為抵抗傳染病基本武器的重要性，但另一方面也凸顯了一部分人的猶豫行為。許多研究已報道了造成這種態(tài)度的幾個原因，但許多研究表明，最主要的原因是疫苗副作用的恐懼和疫苗組成的不信任，特別是佐劑是一種比其他成分更能引起公眾關(guān)注的成分。事實上，疫苗的副作用通常是輕微和短暫的，其通常表現(xiàn)為注射部位的局部疼痛和紅斑，輕微的全身不適和流感樣癥狀，這些影響通常在接種疫苗幾小時或幾天后消失，很少有過敏反應(yīng)或其他嚴(yán)重副作用的病例報道。
這篇綜述評價了當(dāng)前使用的疫苗佐劑，評估正在進(jìn)行關(guān)于佐劑的特性和未來可能使用的研究，強調(diào)科學(xué)文獻(xiàn)中存在的潛在問題和副作用的依據(jù)。
2.1 礦物鹽
鋁鹽
20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)了鋁鹽的佐劑特性，1926年人們開始用這些化合物作為疫苗佐劑。最初考慮在培養(yǎng)基中添加鋁鹽，以便誘導(dǎo)破傷風(fēng)和白喉抗原的沉淀，從而幫助其純化。然而，其結(jié)果表明，鋁沉淀抗原比可溶性抗原具有更強的免疫原性。因此，鋁鹽是使用時間最長和最常用的佐劑，目前認(rèn)證的疫苗中約有三分之一含有鋁。因此，鋁鹽是疫苗佐劑中安全性測試最多的佐劑。
人類通過不同的途徑接觸到鋁，尤其是食物和空氣。它主要通過消化道和呼吸道被人體吸收，隨后進(jìn)行擴(kuò)散，然后經(jīng)過三步排除過程，可是這一過程永遠(yuǎn)不會完成。低于3%的吸入鋁和1%的攝入鋁擴(kuò)散到整個生物體。然而，在人體中發(fā)現(xiàn)95%的鋁通過受污染的食物攝入的。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定通過食物攝入鋁的最高水平應(yīng)為1mg/kg/d(成人為60至70mg/d)。最后，鋁包含在腸外溶液內(nèi)，因此，通過注射擴(kuò)散到血液和各種體液區(qū)室，在這種情況下，為了避免鋁的積累，其在靜脈注射溶液中的濃度應(yīng)<25g/L。
鋁一旦被生物體吸收，在人體組織中擴(kuò)散。大部分金屬儲存在骨骼、肝臟、肺和神經(jīng)系統(tǒng)中。對于患有慢性腎病的人來說，鋁不能被清除，并隨著時間的推移而積累，尤其是在骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)中積累。在這類病人中高水平的鋁會沉積在大腦中引起腦病。在大鼠體內(nèi)注射同位素鋁-26 (26Al)后其精確地量化了鋁對大腦的滲透。在生理條件下，鋁的腦滲透被量化為每克腦組織的0.001%～0.005%，這與給藥途徑和化學(xué)形式無關(guān)。2010年Goullé等量化了人組織中鋁水平，其應(yīng)用電感耦合等離子體與質(zhì)譜檢測相結(jié)合的技術(shù)對20例已故患者進(jìn)行分析，這些患者以前沒有接觸過金屬，也沒有接受過任何含鋁或其他微量礦物質(zhì)的治療，以濕重表示的中位數(shù)結(jié)果如下:肺=0.47g/g，腦=0.19g/g，肝臟=0.15g/g，心臟=0.10g/g，肌肉=0.08g/g和腎臟=0.06g/g。
鋁主要通過泌尿系統(tǒng)被生物體緩慢排出。有些鋁會永久沉積在人體內(nèi)，其含量會隨著接觸程度和年齡的增加而增加。在成年人體內(nèi)永久沉積鋁的量約為30～50mg。
在疫苗中鋁以結(jié)晶氫氧化鋁(AlH)復(fù)雜聚合物或無定形羥磷酸鋁(AlP)的簇狀納米顆粒形式存在。AlH呈針狀納米顆粒(?20nm)，而AlP在透射電鏡下呈網(wǎng)狀。這兩種形式通常溶于檸檬酸鹽，但AlP比AlH更易溶解?？乖ㄟ^靜電相互作用和配體交換吸附到佐劑顆粒表面。鋁鹽抗原結(jié)合增強抗原提呈細(xì)胞(APCs)對抗原的攝取和提呈。而且，鋁鹽刺激NLRP3炎癥小體的作用，導(dǎo)致IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，引起局部炎癥和APCs的募集。
許多疫苗是抗原吸附在AlH或AlP上(例如，白喉和破傷風(fēng)疫苗、無細(xì)胞百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗以及肺炎球菌和腦膜炎球菌疫苗)。因為它們的免疫原性弱，需要增強免疫反應(yīng)，以便引起有效的疫苗接種。在歐洲，《歐洲藥典》規(guī)定疫苗中的鋁含量最高不超過1.25mg/劑。在美國，《美國聯(lián)邦法規(guī)》規(guī)定生物制品(包括疫苗)中的鋁含量為0.85mg/劑。鋁主要以可溶性檸檬酸鹽或氯化物鹽的形式存在于食物中，而無機鋁化合物的佐劑是難溶的，這是佐劑作用方式的一部分。因此，由于鋁在生理pH值下的溶解度較差，肌肉注射或皮下注射后疫苗中鋁的吸收率預(yù)計會非常慢。
為了評估肌肉注射后鋁的動力學(xué)，F(xiàn)larend等人進(jìn)行了一些體內(nèi)研究，通過肌肉注射26Al標(biāo)記的AlH和AlP，其總鋁劑量為0.85 mg，實驗28天內(nèi)AlH吸收率為17%，AlP吸收率為51%。26Al的最大血清濃度(Cmax)是2μg/L，即家兔鋁的正常值(30μg/L)為7%?；谶@些結(jié)果，肌內(nèi)注射鋁鹽疫苗佐劑后鋁Cmax的預(yù)期增加量為0.04μg/L，即平均血鋁水平5 μg/L的0.8%。在本試驗中，大腦中的鋁水平濃度在10 - 8～10 - 7mg/g之間，即10?5～10?4μg/g，因此<0.0001μg/g，這比人腦中0.2μg/g的平均濃度低2000多倍。此外，一些研究評估了注射檸檬酸26Al后人體內(nèi)鋁的排泄情況。一項相當(dāng)古老的研究表明，靜脈注射26檸檬酸鋁后，59%的注射劑量在一天內(nèi)隨尿排出，隨后幾天排出速度變慢(第5天平均滯留率為27%)，而最近的一項研究表明，在注射鋁劑8年后，殘留率約為2%。
鋁的毒性僅次于體液和組織中增加的金屬水平。特別是當(dāng)腎功能受損時，這種增加是排除它的能力而改變的。尤其血液透析的腎功能衰竭患者具有較高的鋁水平，伴隨可能的神經(jīng)毒性風(fēng)險。腎移植能夠解決鋁的過剩，并可能解決相關(guān)的神經(jīng)毒性。多年來，科學(xué)家們一直在爭論神經(jīng)退行性疾病可能是鋁致神經(jīng)毒性，到目前為止，還沒有確鑿的證據(jù)表明，這一作用仍然存在爭議。
鋁的神經(jīng)毒性已在體外、離體和體內(nèi)動物模型和人體中進(jìn)行了研究。在體外對細(xì)菌進(jìn)行了一些研究，顯示鋁不存在致突變性，此外，使用對氧化誘變劑敏感的菌株后，對鋁的氧化作用模式產(chǎn)生了疑問。在體外對細(xì)胞系進(jìn)行了研究，以評估不同形式的鋁可能的遺傳毒性。研究人員在細(xì)胞系進(jìn)行評估不同形式的鋁可能引起的遺傳毒性。一些科學(xué)家使用多個供體的淋巴細(xì)胞在動物模型中進(jìn)行胚胎毒性研究，最后，在體內(nèi)進(jìn)行各種研究。在這些研究中最常用的技術(shù)是彗星試驗和微核試驗。有趣的是，研究結(jié)果往往不一致和相互矛盾，這可能存在方法上的缺陷。因此，到目前為止，盡管鋁鹽能夠產(chǎn)生或多或少強烈的氧化應(yīng)激，但仍不能肯定地說(在推薦劑量下)用作佐劑的鋁鹽會有毒性作用。
2.2 乳劑
這一類重要佐劑的前身是完全和不完全的弗氏佐劑。這兩種佐劑都是油包水乳劑，其能夠提呈抗原并刺激先天免疫系統(tǒng)。在其構(gòu)造中完全弗氏佐劑(CFA)包括熱殺死的分枝桿菌，它增強了刺激免疫反應(yīng)，目前其誘導(dǎo)小鼠強烈的免疫激活和自身免疫(如葡萄膜炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎)。然而，CFA能夠引起強烈的和持久的局部炎癥，這可能導(dǎo)致動物明顯的疼痛，并可能在注射部位發(fā)生潰瘍。不完全弗氏佐劑(IFA)不含分枝桿菌，在20世紀(jì)50年代被用作人流感疫苗的佐劑，與無佐劑的相同疫苗相比，它可以誘導(dǎo)更強、更持久的抗體反應(yīng)。IFA的佐劑活性是基于油性抗原沉積的特征，抗原在注射部位持續(xù)釋放，這同時導(dǎo)致抗原壽命的增加以及強烈的局部先天免疫刺激，伴隨吞噬、白細(xì)胞募集和浸潤以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。然而，IFA的強烈副作用，疫苗配方中應(yīng)用IFA及其人類的常規(guī)使用受到阻礙。特別是，毒性是含量高的非生物降解的廢油以及它們的品質(zhì)差引起的。2005年WHO進(jìn)行的一項調(diào)查顯示，大約100萬名IFA患者進(jìn)行免疫接種后出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用，例如在4萬名接種疫苗的人中出現(xiàn)了無菌膿腫。
2.2.1 MF59
MF59是一種油包水乳劑，其由角鯊烯、Span 85和Tween 80組成，其溶解于pH 6.5的10 mM檸檬酸鈉緩沖液，平均粒徑約為165 nm。這是1997年意大利批準(zhǔn)的第一種用作人類疫苗的水包油乳劑。它目前用于三價和四價(TIV和QIV)流感疫苗Fluad (Seqirus)，這些疫苗最初僅用于65歲以上的人群，但后來被批準(zhǔn)用于其他流感風(fēng)險群體如幼兒和嬰兒，并在H1N1大流行疫苗期間用于孕婦和幼兒。研究表明：MF59的存在可提高2歲以下兒童流感疫苗的有效性。MF59還作為HBV疫苗的佐劑進(jìn)行了測試，其能夠引起強烈的免疫反應(yīng)，而且比鋁誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更好。MF59的作用機理與鋁鹽相似。注射部位的儲存狀況幾乎可以忽略不計，因為研究表明其半衰期為42h。相反，MF59具有誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的強大能力，包括產(chǎn)生高滴度的功能性抗體。MF59的存在刺激局部先天免疫細(xì)胞分泌趨化因子，如C-C基序趨化因子配體4 (CCL4)，C-C基序趨化因子配體25 (CCL2)， C-C基序趨化因子配體5 (CCL5)和C-X-C Motif配體8 (CXCL8)，它反過來驅(qū)動白細(xì)胞募集、抗原攝取和遷移到淋巴結(jié)，觸發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。另外，研究報道，MF59能夠增加調(diào)節(jié)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的基因簇的表達(dá)，以及隨后招募的MHCII+CD11b+細(xì)胞進(jìn)入注射部位，引發(fā)強大的免疫應(yīng)答。在35個國家數(shù)百萬劑的應(yīng)用證明了MF59是安全且耐受性良好。
2.2.2 AS03
AS03是由表面活性劑聚山梨酸酯80和角鯊烯和DL-α-生育酚兩種可生物降解的油脂在磷酸鹽緩沖鹽水中組成的油包水佐劑乳液。這種佐劑已用于流感疫苗，引起類似MF59的免疫反應(yīng)，也用于瘧疾疫苗。2009年歐盟委員會批準(zhǔn)AS03佐劑的疫苗Pandemrix上市，而2013年，美國食品和藥物管理局(FDA)獲批了一種AS03佐劑甲型流感(H5N1)單價疫苗。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激特性似乎比MF59增強了免疫刺激。事實上，在6至35個月的兒童中使用AS03佐劑流感疫苗顯示出強烈的免疫反應(yīng)，甚至在接種疫苗6個月后也是如此。為了闡明DL-α-生育酚在AS03中的作用，我們比較了AS03和缺乏DL-α-生育酚的乳劑的作用。通過測定抗原攝取、免疫細(xì)胞募集和分泌的細(xì)胞因子水平，我們得出結(jié)論是缺乏DL-α-生育酚導(dǎo)致免疫應(yīng)答和抗體滴度降低。而且，有研究表明AS03能夠通過激活NF-κB刺激免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)肌肉和淋巴結(jié)分泌細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)先天免疫細(xì)胞的遷移。另外，AS03可刺激CD4+ T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)，這可以決定持久的中和抗體產(chǎn)生和更高水平的記憶B細(xì)胞。AS03的成分進(jìn)一步添加了兩種強免疫刺激劑，即QS-21(一種從黃芪中提取的皂苷)和3- O -去酰基-40 -單磷酰脂質(zhì)A (MPL)，以增強其免疫原性，從而形成AS02。
2.3 微粒
2.3.1 病毒樣顆粒
病毒樣顆粒(VLP)是由自組裝衣殼蛋白外殼組成的二十面體或棒狀納米顆粒(? 20 - 200nm)。長期以來，人們一直在研究并將其用于疫苗開發(fā)。它們是非傳染性粒子，因為它們不包含任何遺傳物質(zhì)。它們是一種被稱為納米疫苗的最重要代表之一新型疫苗，這種疫苗在疫苗開發(fā)中正變得越來越重要。VLP是一種智能納米顆粒，因為它們是具有重復(fù)表位的外部病毒外殼形成，免疫系統(tǒng)將其識別為非自身，從而產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。然而，它與天然病毒共有的這一特性，但并不具有感染的能力。除了這些重復(fù)的結(jié)構(gòu)基序外，VLPs的大小與病毒相似(通常在20-800nm之間)，并且經(jīng)過快速有效的處理，即使在沒有佐劑的情況下也能產(chǎn)生快速而持久的免疫反應(yīng)。根據(jù)是否存在包膜，VLPs可分為非包膜VLPs和包膜VLPs (eVLP)，無包膜VLPs又可分為單衣殼蛋白VLPs和多衣殼蛋白VLPs，以及單層、雙層和三層VLPs。多衣殼無包膜的VLPs一個經(jīng)典例子是由乳頭瘤病毒L1和L2蛋白形成的，它們能夠自組裝形成微粒。eVLP從宿主細(xì)胞獲得脂質(zhì)膜，在組裝和出芽過程中表達(dá)，又分為單層、雙層和多層。它們可以由不同的病毒類型形成，其表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌，酵母(釀酒酵母和畢赤酵母)、桿狀病毒、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞和無細(xì)胞系統(tǒng)。在細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)VLP采用一種稱為“組裝-然后純化”的多步驟方法，首先利用衣殼蛋白的自發(fā)組裝能力直接出現(xiàn)在表達(dá)細(xì)胞載體內(nèi)，其次純化新形成的顆粒。有時，為了獲得較純的顆粒，在細(xì)胞內(nèi)組裝后，新顆粒必須分解，從而使它們第二次重新組合。另一種制造方法使用無細(xì)胞體外組裝加工系統(tǒng)，其組成與傳統(tǒng)細(xì)胞方法的相反，特別是，它們在表達(dá)和純化后，體外表達(dá)系統(tǒng)被用于生產(chǎn)衣殼蛋白自發(fā)組裝的平臺，而無需拆卸新形成的VLPs。目前，有兩種重要的添加佐劑的疫苗使用納米顆粒平臺產(chǎn)生免疫:乙型肝炎和乳頭瘤病毒(HPV)疫苗。當(dāng)前，使用的乙型肝炎疫苗是一種含有乙型肝炎表面抗原的重組疫苗(HBsAg)，以VLPs的形式，用于預(yù)防乙肝感染，其利用重組DNA技術(shù)，以釀酒酵母為表達(dá)載體生產(chǎn)疫苗。每個劑量含有10μg/0.5 mL VLPs(兒童)或20μg/mL(成人)，兩者都吸附于氫氧化鋁。該疫苗接種于15歲以下的嬰兒、兒童和青少年，或感染乙型肝炎的高危人群，在乙肝病毒攜帶者母親所生的新生兒中也顯示出極好的免疫原性(95% - 99%的有效性)。乙肝疫苗似乎能提供至少10年的免疫力。
HPV疫苗也是基于VLP平臺的疫苗。HPV病毒粒子是非包膜的，含有雙鏈DNA (dsDNA)。衣殼具有二十面體對稱性，由主要結(jié)構(gòu)蛋白和次要結(jié)構(gòu)蛋白組成，即L1蛋白和L2蛋白。目前的九價HPV疫苗可預(yù)防九種不同的病毒基因型，這些病毒基因型可導(dǎo)致90%的宮頸癌和80-95%的肛門生殖器癌，建議從9歲開始對男性和女性接種。九價型HPV疫苗含有9種不同HPV基因型(6、11、16、18、31、45、53、58)的L1蛋白形成VLPs，并通過重組DNA技術(shù)合成。VLPs的優(yōu)勢在于它是一種不含病毒基因組的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，不具有傳染性和致癌性。目前用于表達(dá)L1蛋白的載體是釀酒酵母。VLPs與佐劑(AlP)協(xié)同使用可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，因此預(yù)防宮頸癌達(dá)90%。此外，事實證明，疫苗誘導(dǎo)的抗體能夠穿過胎盤，保護(hù)新生兒免受HPV 6和11的感染。
2.3.2 病毒顆粒
病毒體是一種與天然病毒結(jié)構(gòu)非常相似的疫苗平臺。在結(jié)構(gòu)上，它們是重組流感病毒包膜形成的VLPs，由血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和磷脂(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿)組成，缺乏病毒遺傳物質(zhì)。1975年首次提出使用病毒顆粒生產(chǎn)流感疫苗。自此，出現(xiàn)了這類疫苗有效性的科學(xué)證據(jù)，并用于預(yù)防甲型肝炎(Epaxal)和流感(Inflexal)的兩種疫苗。Inflexal Ⅴ是一種適用于所有年齡組的佐劑流感疫苗，對健康和免疫功能低下的兒童、成人和老年人都有良好的療效。它能誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答并產(chǎn)生特異性抗體。病毒顆粒保留了血凝素的受體結(jié)合能力和膜融合活性，但缺乏病毒性RNA，它們結(jié)合后不能誘導(dǎo)細(xì)胞感染。而且與亞基和分裂病毒粒子流感疫苗相比，這種結(jié)合能力增加了它們的免疫原性。病毒顆粒作為一個完美的遞送系統(tǒng)，能夠?qū)⒖乖D(zhuǎn)移到抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的細(xì)胞質(zhì)中，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。然而，由于它們較弱的佐劑特性，病毒顆粒不能有效的激活A(yù)PC和促進(jìn)交叉呈遞。這種內(nèi)在的限制可以通過添加更強的佐劑來去除。例如基于TLR4配體單磷酰脂質(zhì)A (MPLA)和金屬離子螯合脂質(zhì)DOGS-NTA-Ni吸附到膜上的病毒顆粒，研制了一種新型流感疫苗。在體外，與未添加佐劑的病毒顆粒相比，吸附了MPLA的病毒顆粒能夠誘導(dǎo)更強的APCs活化。此外，具有MPLA佐劑的病毒顆粒免疫小鼠誘導(dǎo)特異性CTLs的產(chǎn)生。
生產(chǎn)的流感病毒顆粒使用洗滌劑(乙二醇)-正十二烷基單醚(C12E8)溶解病毒包膜，隨后進(jìn)行超離心并去除病毒核衣殼，然后，使用疏水珠從上清液中去除洗滌劑，隨后病毒膜脂和包膜糖蛋白重新組裝，形成約100-200 nm的顆粒。研究表明，這一過程形成的流感病毒顆粒表現(xiàn)出與野生型病毒非常相似的融合特性。流感病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，然后與核內(nèi)體膜融合。由于膜融合活性，不同的大分子可以被包裹在病毒顆粒腔內(nèi)到達(dá)靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。例如，包裹在病毒顆粒內(nèi)的DTA(白喉毒素的A亞基)可以成功地轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的完全抑制，甚至質(zhì)粒DNA也可被包裹在陽離子脂質(zhì)形成的病毒顆粒內(nèi)。這種病毒顆粒DNA可以有效地轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。
病毒顆粒傳遞系統(tǒng)和佐劑的顯著優(yōu)勢是能夠通過疏水脂質(zhì)相互作用將抗原吸附到它們的表面和管腔上。而且，在疫苗生產(chǎn)中病毒顆粒比VLPs更受歡迎，因為后者由于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)運動受到限制。此外，將抗原吸附到病毒顆粒的液體磷脂雙分子層表面會刺激與宿主細(xì)胞受體的相互作用。FDA已批準(zhǔn)病毒顆粒作為人類使用的納米載體，因為它們具有很高的耐受性和安全性。與亞單位疫苗引起較弱的免疫反應(yīng)相比，病毒顆粒能夠誘導(dǎo)強大的體液和細(xì)胞免疫，這與自然感染和其他強效佐劑具有非常相似的方式。
目前為止，除了上述兩種流感和甲型肝炎的基于病毒顆粒的疫苗外，這幾種基于病毒顆粒的HIV、HPV、RSV和瘧疾疫苗也在研究。
艾滋病毒顆粒疫苗在臨床I期顯示出符合期望的結(jié)果，有可能很快會上市。盡管疫苗可以通過肌肉注射或皮下注射，但粘膜途徑可能引起更強的免疫反應(yīng)，因為艾滋病毒傳播的主要途徑是粘膜組織，因此，強大的粘膜抗體產(chǎn)生是抵抗HIV感染的重要防御機制。研究人員已經(jīng)從流感病毒中制備了基于HIV病毒顆粒的疫苗，其主要通過吸附一些HIV-1毒力抗原，如gp41和p1肽，并加入3M -052和一種增加病毒顆粒膜硬度的耐熱佐劑。另一項研究，一種熱穩(wěn)定性的HIV-1病毒顆粒疫苗由流感包膜的病毒顆粒組成，其含有HA、NA、卵磷脂、腦磷脂和其他磷脂，外加3M-052、toll樣受體(TLR7/8)和海藻糖。
關(guān)于HPV，一些研究側(cè)重于含有E6和E7蛋白的基于病毒顆粒的疫苗，其通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用與宿主細(xì)胞膜融合。研究表明，重組HPV16 E7流感病毒顆粒誘導(dǎo)了強烈的CTL反應(yīng)，并阻止了HPV16+向癌癥轉(zhuǎn)化。此外，用E7病毒顆粒免疫誘導(dǎo)了抗E7的IgG抗體反應(yīng)。
3.1 TLR1/2激動劑
在TLR1/2激動劑中，L-pampo是一種由Pam3Csk4(Pam3)和多肌苷:多胞苷酸(polyI:C)組成的強效佐劑體系，其分別為強效TLR1/2和TLR3激動劑。Lee等人研究表明L-pampo誘導(dǎo)的抗HBV抗體的產(chǎn)生比明礬更強，并且還參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如增加多功能CD4+ T細(xì)胞。此外，還研究了抗SARS-CoV-2的有效佐劑。具體而言，與廣泛使用的佐劑相比，SARS-CoV-2抗原如受體結(jié)合域(RBD)和S1抗原，或RBD- Fc接合L-pampo可對SARS-CoV-2產(chǎn)生強烈的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
此外，細(xì)菌脂蛋白是TLR2識別的最有效的配體。研究表明，從細(xì)菌脂蛋白中提取的合成脂肽是B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強激活劑，可以用作疫苗佐劑。來自發(fā)酵支原體的2 kDa巨噬細(xì)胞激活脂肽-2 (MALP-2)通過TLR2-和myd88依賴的信號通路激活免疫細(xì)胞。除MALP-2外，Pam2CSK4和Pam3CSK4也是公認(rèn)的TLR2激動劑，它們已被評估為治療利什曼原蟲、瘧疾和流感等傳染病的藥物。
TLR3受體激動劑
在發(fā)現(xiàn)TLRs之前，一種合成的dsRNA，即[poly(I:C)]被發(fā)現(xiàn)具有高度誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的能力。TLR3是一種檢測病毒dsRNA的細(xì)胞核內(nèi)體的受體，它識別poly(I:C)，因為它在結(jié)構(gòu)上模擬病毒RNA，從而誘導(dǎo)I型IFN和III型IFN的產(chǎn)生，并引起Th1細(xì)胞因子反應(yīng)。在TLR3- poly(I:C)相互作用后產(chǎn)生的I型IFN對于常規(guī)樹突狀細(xì)胞(cDCs)有效激活CD8 T細(xì)胞反應(yīng)尤為重要。另外，poly(I:C)產(chǎn)生的I型IFN刺激T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，增加效應(yīng)T細(xì)胞的比例和抗原特異性B細(xì)胞的數(shù)量。由于這些原因，poly(I:C)作為一種潛在的佐劑已被廣泛研究，然而，poly(I:C)對人體有毒性作用。因此，科學(xué)家們的關(guān)注點已集中在poly(I:C)的衍生物，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成的TLR3激動劑，如ARNAX, IPH3102和RGC100。Poly(ICLC)是羧甲基纖維素中的poly-L-賴氨酸，與poly(I:C)類似，其能夠刺激IFN的產(chǎn)生。然而，它對血清核酸酶具有較高的抗性，同時具有較高的免疫刺激作用。poly(ICLC)的一個有趣的方面是能夠誘導(dǎo)天然免疫途徑中其他幾個基因序列的表達(dá)，包括炎性體和補體系統(tǒng)AS，類似于活病毒疫苗。迄今為止，一些研究已經(jīng)使用聚(ICLC)作為傳染病的候選疫苗，如惡性瘧原蟲和HIV以及癌癥。研究表明，與其他TLR激動劑(如LPS和CpG)相比，poly(ICLC)能夠引發(fā)更強的Th1免疫應(yīng)答，這是疫苗接種的一個積極方面。Poly(IC12U)通過尿嘧啶和鳥苷殘基之間的錯配降低Poly(I:C)的毒性。然而，盡管這種變化降低了毒性，但它導(dǎo)致I型IFN的產(chǎn)量低于poly(I:C)。與poly(I:C)和poly(ICLC)不同，poly(IC12U)與TLR3結(jié)合，但不與MDA5結(jié)合。與poly(ICLC)類似，一些研究將ploy(IC12U)作為HIV、流感和癌癥疫苗的佐劑。ARNAX是一種具有佐劑潛力的TLR3激動劑，它是一種TLR3特異性配體，其毒性低于poly(I:C)。poly(I:C)的毒性與其激活MAVS通路(RIG-I和/或MDA5的激活)的能力有關(guān)。因此，Matsumoto等人開發(fā)了一種包括GpC磷酸化寡脫氧核苷酸和dsRNA的配體，該配體被TLR3識別并內(nèi)化到核內(nèi)體中。由于RNA鏈的長度相對較短，該配體能夠激活TLR3，同時避免MDA5的檢測。在小鼠模型中，佐劑不能誘導(dǎo)血清炎癥細(xì)胞因子水平的顯著增加，但有利于DC交叉呈遞抗原并引發(fā)Th1譜。研究ARNAX最重要的兩個領(lǐng)域是癌癥免疫治療和流感疫苗接種。
3.2 TLR4激動劑
TLR4激動劑作為疫苗佐劑有AS01、AS02和AS04，它們都含有TLR4內(nèi)體的配體MPLA。
具體來說，AS01已被用于開發(fā)瘧疾、艾滋病毒和結(jié)核病的疫苗。AS01是一種包裹在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中復(fù)合佐劑，其由兩種不同的免疫刺激分子MPLA和QS-21組成。QS-21是一種天然的三萜苷類皂苷類物質(zhì)，提取自枇杷膏的樹皮。這兩種化合物利用脂質(zhì)體作為載體通過膽固醇依賴性內(nèi)吞作用到達(dá)細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，QS-21導(dǎo)致溶酶體不穩(wěn)定并促進(jìn)蛋白激酶SYK的激活。MPLA連接內(nèi)體TLR4，誘導(dǎo)TRIF依賴的信號通路。單獨使用QS-21具有重要而不利的溶血作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。然而，溶血活性的QS-21和隨后的細(xì)胞死亡通過脂質(zhì)體包封終止。AS01激活細(xì)胞凋亡蛋白酶-1，從而促進(jìn)NLRP3炎性體的激活和從APCs中釋放IL-1β和IL-18。IL-18的釋放導(dǎo)致IFN-γ的快速產(chǎn)生，尤其是淋巴結(jié)中的自然殺傷細(xì)胞，從而促進(jìn)DC的成熟并誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)。
3.3 TLR5激動劑
TLR5是一種識別細(xì)菌鞭毛蛋白的受體，它由幾種免疫細(xì)胞表達(dá)。TLR5與配體的結(jié)合導(dǎo)致炎癥途徑的激活和許多炎癥介質(zhì)的釋放，如TNF-α， IL-1β， IL-6和NO。此外，鞭毛蛋白能夠引起Th1和Th2反應(yīng)，而不像其他TLR配體只能夠引起Th1反應(yīng)。另外，鞭毛蛋白通過激活NLRC4炎性體誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生和釋放。鞭毛蛋白不依賴TLR5或NLRC4的模型能夠發(fā)揮佐劑活性，但效率低于野生型。事實上，在小鼠模型中這兩種受體都不存在時，佐劑的能力大大降低，這表明至少需要一種受體存在才能驅(qū)動免疫反應(yīng)；而兩者的存在提供了最好的免疫結(jié)果。研究表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人群中仍能維持其佐劑作用，例如HIV陽性的病人。Cui等評論了使用鞭毛蛋白作為佐劑的研究。最簡單的方法是抗原給藥，該方法成功地誘導(dǎo)了黏膜免疫反應(yīng)，對防止呼吸道和胃腸道感染至關(guān)重要。研究人員已經(jīng)開展了許多研究，特別是關(guān)于鞭毛蛋白作為流感疫苗佐劑的作用。鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白與不同的流感抗原聯(lián)合使用，如滅活的PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV)H5N1都獲得了強大的免疫反應(yīng)(特別是產(chǎn)生IgA的粘膜)。在活減毒細(xì)菌中修飾的鞭毛蛋白獲得了嵌合鞭毛蛋白或鞭毛蛋白抗原復(fù)合物，例如結(jié)核分枝桿菌、霍亂弧菌、化膿性鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)。此外，重組鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生產(chǎn)已在動物模型中用于傳染病和癌癥的佐劑疫苗。迄今為止，至少有三種用鞭毛作為佐劑的疫苗處于臨床試驗階段:兩種是流感病毒，另一種是鼠疫耶爾森氏菌。
3.4 TLR7/8激動劑
一些研究表明TLR7/8激動劑能夠強烈誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答。與TLR7/8結(jié)合的配體產(chǎn)生高水平的I型IFN，IL-12, TNF-α和IL-1β。另外，TLR7/8和TLR9激動劑是唯一能夠激活和促進(jìn)cDCs和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)克隆擴(kuò)增的激動劑分子，也能調(diào)動CD14+CD16+炎癥單核細(xì)胞和CD14dimCD16+巡邏單核細(xì)胞。TLR7/8激動劑最重要的代表是一些合成的小分子，命名為咪喹莫特(R837)和瑞喹莫特(R848)，其屬于咪唑喹啉類。當(dāng)今咪喹莫特被批準(zhǔn)用于治療生殖器疣、淺表基底細(xì)胞癌和光化性角化病，而雷西喹莫特已被研究用于抗病毒和抗癌治療。然而，這些小分子已被證明有一些內(nèi)在的限制。特別是，它們可以擴(kuò)散到遠(yuǎn)離給藥部位的地方，從而遠(yuǎn)離抗原，從而降低療效并誘發(fā)全身副作用。因此，研究已證明這些分子與鋁佐劑的直接結(jié)合能夠提高疫苗的效力。先前的一些研究將咪唑喹啉類藥物與HIV-1 Gag蛋白或整個滅活流感病毒直接偶聯(lián)，增加了Th1應(yīng)答和抗原特異性的T細(xì)胞數(shù)量。此外，它與合成聚合物支架、脂質(zhì)-聚合物兩親體、聚乙二醇(PEG)、納米凝膠、明鋁和各種其他合成聚合物的偶聯(lián)顯著增加了咪唑喹啉類藥物的遞送，并促進(jìn)了DC和抗原特異性T細(xì)胞的成熟。而且，咪唑喹啉與一種或多種其他TLR激動劑(如MPLA (TLR4)和MPLA + CpG ODN (TLR4和TLR9)混合研究表明，這種組合增加了先天免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了顯著抗原特異性中和抗體和改善Th1反應(yīng)。所有這些創(chuàng)新方面都突出了TLR7/8激動劑作為佐劑候選藥物的卓越潛力。
3.5. TLR9激動劑
TLR9自然識別以未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸為代表的細(xì)菌DNA基序，通過myd88依賴途徑驅(qū)動先天免疫系統(tǒng)的激活。這些分子基序用于具有特定修飾的合成佐劑，以防止被核酸酶降解。在自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞和pDCs中，CpG-ODNs產(chǎn)生強大的趨化因子、細(xì)胞因子和抗體，驅(qū)動強烈的Th1型免疫反應(yīng)。迄今為止，研究人員已開發(fā)了三種不同類型的CpG-ODN配體，其分為三類(A - C)，但只有B類分子作為佐劑用于臨床試驗。CpG-B ODN定位于核內(nèi)體并引起pDCs成熟。此外，CpG-B ODN可以直接與B細(xì)胞相互作用，增強抗體的產(chǎn)生。在小鼠模型中顯示，CpG-B ODN作為佐劑可產(chǎn)生可觀且持久的抗體，優(yōu)于鋁佐劑或非佐劑疫苗。最近許可的CpG 1018是一種具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和佐劑能力的寡核苷酸，可引發(fā)Th1型免疫反應(yīng)，被用作乙肝疫苗Heplisav-B的佐劑。Heplisav-B中的CpG 1018提高了疫苗效力，與需要三劑才能產(chǎn)生最佳保護(hù)的傳統(tǒng)乙型肝炎疫苗相比，只需接種兩劑即可。目前為止，CpG 1018正在用于開發(fā)幾種疫苗，包括針對黑色素瘤和COVID-19的疫苗，另一種CpG ODN CpG 7909在HBV和瘧疾疫苗臨床評估中顯示出令人鼓舞的效果，其他下一代TLR9激動劑已開發(fā)。一個有效的代表是MGN1703，其包括CG基序的小DNA分子，但它在結(jié)構(gòu)上不同于CPG ODN。MGN1703是一段中間為雙鏈的反向互補DNA組成，兩個單鏈環(huán)包圍，它包括三個非甲基化的CG基序并形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，與線性分子CpG ODNs形成對比。MGN1703作為癌癥疫苗的佐劑進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)它能夠激活先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，只有輕微或暫時的副作用。
盡管疫苗具有良好的安全性，但近年來，人們對疫苗可能產(chǎn)生的負(fù)面影響產(chǎn)生了新的關(guān)注，除了眾所周知的副作用外，還描述了一種新的疾病分類學(xué)實體。最早由Shoenfeld等人提出實體是佐劑誘導(dǎo)的自身免疫/炎癥綜合征(ASIA)。這種綜合征包括一些免疫介導(dǎo)的疾病，這些疾病可能發(fā)生在暴露于佐劑后的易感遺傳個體中。其特征主要是自身抗體的產(chǎn)生，一旦觸發(fā)因子被移除，情況會好轉(zhuǎn)。該綜合征發(fā)病時，一些外部因素如感染性因子或佐劑(即粉塵、硅膠、鋁鹽等)作用于易感遺傳背景，其通過自身免疫性疾病(ADI)發(fā)展相關(guān)的特定HLA抗原介導(dǎo)。尤其是這些患者中HLA-DRB1和PTPN22基因同時存在已證明是最常見的自身免疫背景。根據(jù)最近的科學(xué)證據(jù)，一些病理情況，如結(jié)節(jié)病、Sj?gren綜合征(SS)、未分化結(jié)締組織病(UCTD)、硅膠植入物不相容綜合征(SIIS)和免疫相關(guān)不良事件(irAEs)是ASIA背景的典型例子。除了疫苗中含有的常見佐劑外，許多其他物質(zhì)如硅酮、石蠟、透明質(zhì)酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也具有佐劑的特性。
Watad等人將ASIA標(biāo)準(zhǔn)分為主要標(biāo)準(zhǔn)和次要標(biāo)準(zhǔn)。在臨床表現(xiàn)之前，主要標(biāo)準(zhǔn)包括暴露于各種外源性刺激(感染、接觸佐劑)以及出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)，如肌痛、肌炎、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎、慢性疲勞、睡眠障礙、脫髓鞘、記憶喪失、發(fā)熱和口干。次要標(biāo)準(zhǔn)包括自身抗體或針對佐劑的抗體的出現(xiàn)，特定HLA模式(即HLA DRB1, HLA DQB1)的存在，以及自身免疫性疾病的發(fā)展，即多發(fā)性硬化癥或系統(tǒng)性硬化癥。
以前的一些研究表明含有鋁鹽的疫苗能引起ASIA。一個典型的例子是HPV四價疫苗(含鋁鹽)，據(jù)報道，接種疫苗后幾周內(nèi)易感受試者的自我免疫風(fēng)險會增加，它或者是HBV疫苗。然而，Linneberg研究鋁鹽潛在副作用結(jié)果表明，與接受常規(guī)過敏治療的對照組相比，經(jīng)皮下多次過敏原聯(lián)合氫氧化鋁免疫治療以及隨后接受比三劑疫苗中含鋁量高100倍人死亡率更低，自身免疫性疾病更少。
科學(xué)家們的努力已轉(zhuǎn)向研究生物標(biāo)志物診斷ASIA或預(yù)測它的易感性(除了之前已經(jīng)提到的)。例如，在患有ASIA受試者中ACE 1和IL-2受體增加50%，維生素D的缺乏增加了ASIA的發(fā)病率(缺乏免疫調(diào)節(jié)作用)。通過對500例ASIA的分析，Watad等人強調(diào)了易感性似乎與ASIA非常相關(guān)。這項研究表明，女性個體、吸煙者、以往患有自身免疫性疾病或家庭成員患有后者的人患ASIA的比例較高。其中多基因自身免疫性疾病最為常見，UCTD和Sj?gren綜合征患病率最高，分別為38.8%和16.8%。在54.4%自身抗體檢測陽性的患者中48.2%為ANA陽性。很明顯，考慮到自身免疫/自身炎癥狀態(tài)的發(fā)展背后，其有環(huán)境和遺傳因素。接種疫苗與出現(xiàn)癥狀之間的中位時間為一周(2天至5年)；48.2%的人群在接觸至少一種疫苗后出現(xiàn)臨床癥狀。然而，除了這一科學(xué)證據(jù)外，一些研究表明接種佐劑疫苗與ASIA之間沒有關(guān)系。在這些研究中，已表明疫苗接種和自身免疫之間的聯(lián)系可能是虛假的，因為存在混淆因素和隨機事件的結(jié)果，而不是真正的因果關(guān)系。疫苗接種或接觸外來物質(zhì)與自身免疫/炎癥和免疫介導(dǎo)事件的潛在發(fā)生之間可能存在的聯(lián)系不應(yīng)成為降低疫苗接種覆蓋率的“虛假神話”。實際上，疫苗不良事件很少發(fā)生。由于缺乏信息和可靠的數(shù)據(jù)，亞洲是一個恰當(dāng)?shù)目偫ㄐ孕g(shù)語，可以把各種事件和顯然不相關(guān)的反應(yīng)集合在一起，這些反應(yīng)的共同根源是暴露于疫苗、硅膠或其他外來物質(zhì)。需要強調(diào)的是，即使未來的研究表明佐劑和自身免疫之間存在真正的相關(guān)性，然而，這不會削弱疫苗免疫實踐所發(fā)揮的巨大和毋庸置疑的保護(hù)作用，疫苗免疫實踐提供了許多臨床益處；事實上，疫苗有助于根除和控制許多傳染病，提高人類生活質(zhì)量。
疫苗接種一直是人類與傳染病作斗爭的最有力武器之一。由于這些有效和安全的預(yù)防手段，人類已能消滅人類歷史上最可怕的敵人（病原微生物）。最近的COVID-19大流行充分強調(diào)了疫苗接種的重要性，疫苗研究必須取得進(jìn)一步進(jìn)展并為未來的大流行做準(zhǔn)備。疫苗的效力取決于佐劑的基本特性和作用。關(guān)于疫苗接種的未來，必須更加重視這些分子，以便生產(chǎn)出越來越安全有效的疫苗。目前該領(lǐng)域的相關(guān)產(chǎn)品等研究正在進(jìn)行，以便實現(xiàn)這一目標(biāo)，造福人類。
